全反式维甲酸激活前列腺癌细胞中HOXB13基因表达的作用及表观遗传机制研究

【摘要】在西方国家尤其是欧美地区，前列腺癌的发病率和致死率一直都位居前列。在我国，前列腺癌的发病率近年来也表现出急速上升的趋势。传统的治疗手段如外科手术、放射疗法、化学疗法以及激素阻断法对于晚期前列腺癌尤其是雄激素AR抵抗性前列腺癌更是没有太好效果，因此寻求一种更为有效的治疗手段便成为全世界共同的课题。ATRA（全反式维甲酸）作为一种经典的细胞分化剂，除了可以介导肿瘤细胞增殖停滞，分化和凋亡外，还有利于促进晚期肿瘤细胞对于化疗药物的敏感性，能有效治疗急性早幼粒白血病，同时也被证实对于其他多种癌症的都有较好的抗肿瘤作用，其中就包括前列腺癌。HOXB13作为Homeoticgenecluster（HOXs）家族的一个经典成员，位于人类染色体17q21.2位置上。HOXB13的表达具有明显的组织特异性，它部分表达于正常的前列腺组织，少量表达于结肠直肠，在卵巢和睾丸中微量表达，会随着前列腺的癌变和恶化其表达量逐步降低，在AR抵抗性前列腺癌细胞中低表达甚至不表达，外源高表达HOXB13基因能够明显抑制高恶性的AR抵抗性前列腺癌细胞增殖停滞，然而该基因在前列腺癌中表达沉默的机制以及与ATRA的抑制癌症增殖的功能之间的联系尚不清楚。在本论文中，我们对ATRA抑制AR抵抗性高恶性前列腺癌细胞DU145增殖的作用及机制进行了研究。我们发现ATRA能够介导DU145细胞增殖停滞并且上调HOXB13基因的表达。MTT实验显示ATRA抑制前列腺癌DU145细胞的生长要部分依赖于HOXB13基因的表达。荧光素酶双报告基因检测实验显示，ATRA刺激能够上调HOXB13基因启动子的活性。亚硫酸氢钠测序（Bisulfitegenomicsequencing）的研究表明，ATRA处理能够降低HOXB13基因启动子的甲基化水平，同时RT-PCR和Westren-blot实验结果显示，ATRA能够下调前列腺癌细胞中DNA甲基转移酶DNMT3b的表达。我们早期的染色质免疫沉淀（ChIP）和免疫共沉淀（CoIP）实验揭示Polycomb复合物（PRC）成员EZH2不仅可以介导HOXB13基因启动子的H3K27me3修饰，还可以招募DNMT3b到该启动子上，介导DNA甲基化来协同抑制HOXB13基因表达。在我们的研究中，我们发现ATRA处理能够下调EZH2的表达，并且能够抑制EZH2在HOXB13基因启动子上的结合，并降低其在HOXB13基因启动子上所介导的H3K27me3修饰，与此同时在HOXB13基因的启动子上，DNMT3b的结合量也显著减少。DNA甲基转移酶抑制剂5-aza-dC能够通过减少受甲基化修饰基因启动子的甲基化修饰程度上调基因的表达，而我们发现不论在DU145细胞的增殖抑制方面，还是在EZH2，DNMT3b和HOXB13这些基因的表达水平上，ATRA和5-aza-dC处理均能够表现出显著的协同增益效应。我们的实验结果揭示了DNA的甲基化和组蛋白的甲基化共同参与了AR非依赖前列腺癌细胞HOXB13基因的表达沉默，而PcG家族成员EZH2能够招募DNMT3b形成抑制复合物，直接结合到HOXB13基因启动子上抑制其表达；ATRA能够部分通过抵消上述表观遗传修饰上调HOXB13表达从而实现对AR非依赖前列腺癌细胞增殖的抑制；同时ATRA与5-aza-dC共同处理可以更为有效地抑制肿瘤细胞增殖，从而为AR抵抗性高恶性前列腺癌的治疗和研究提供一个新的更为行之有效的思路和策略。
【作者】刘志伟；
【导师】黄百渠；
【作者基本信息】东北师范大学，细胞生物学，2014，博士
【关键词】ATRA；HOXB13；甲基化；EZH2；DNMT3b；增殖停滞；

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